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【问答题】

某一质粒载体具有 Tet<sup>r</sup>和 Kan<sup>r</sup>的表型，在 Kan抗性基因内有一 Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：（1）转化后涂皿时应加什么样的抗生素？（2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？（3）如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？

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第1题

[简答题] λYES（酵母—大肠杆菌穿梭载体）是构建&#160;cDNA&#160;文库的高效载体，这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成，它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA&#160;被插入载体的质粒部分，然后它能在体外被包装入病毒颗粒中，包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌，λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组，并进行独立复制，这就可以从质粒中分离出来，以便进行进一步的遗传操作。&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 为了最大限度地提高克隆效率，载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶&#160;XhoI（5’-C十&#160;TCGAG）进行切割，然后在&#160;dTTP&#160;存在的情况下，同&#160;DNA&#160;聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链&#160;cDNA&#160;同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来，这两段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC&#160;和5’—GGTAAATC，它们的&#160;5’端都是磷酸。然后将载体和&#160;cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用&#160;2μg的7载体和&#160;0.1μg&#160;的&#160;cDNA，构建了一个有&#160;4×10&#160;个克隆的&#160;cDNA&#160;文库。载体和cDNA分子要经过怎样的处理才能提高产生重组&#160;DNA分子的效率？

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第2题

[填空题] 就克隆一个基因（DNA&#160;片段）来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（）、（）、（）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。

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第3题

[简答题] λYES（酵母—大肠杆菌穿梭载体）是构建&#160;cDNA&#160;文库的高效载体，这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成，它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA&#160;被插入载体的质粒部分，然后它能在体外被包装入病毒颗粒中，包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌，λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组，并进行独立复制，这就可以从质粒中分离出来，以便进行进一步的遗传操作。&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 为了最大限度地提高克隆效率，载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶&#160;XhoI（5’-C十&#160;TCGAG）进行切割，然后在&#160;dTTP&#160;存在的情况下，同&#160;DNA&#160;聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链&#160;cDNA&#160;同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来，这两段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC&#160;和5’—GGTAAATC，它们的&#160;5’端都是磷酸。然后将载体和&#160;cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用&#160;2μg的7载体和&#160;0.1μg&#160;的&#160;cDNA，构建了一个有&#160;4×10&#160;个克隆的&#160;cDNA&#160;文库。假定载体长为&#160;43kb，cDNA&#160;的平均长度是&#160;lkb，请估计在连接混合物中，载体分子同cDNA&#160;的比例是多少？

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第4题

[简答题] 用一限制性内切核酸酶切割&#160;Lac+Tetr的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在&#160;lac&#160;基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用&#160;DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化&#160;Lac-Tets受体菌，筛选&#160;Tet&#160;转化子，问：Lacr的基因型是什么？并说明原因。

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第5题

[判断题] 现在最常用的&#160;pUC&#160;载体是&#160;pUCl8，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链&#160;DNA。

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第6题

[] 自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是&#160;ColEl&#160;和&#160;pSCl01&#160;这两个自然质粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造包括哪些基本内容？

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第7题

[判断题] ColEl&#160;是唯一用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选择。

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第8题

[] pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过（）和（）两种质粒改造而来。它的复制子来自（），Amp&#160;抗性基因则是来自（）。

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第9题

[判断题] 噬菌粒（phagemid）pUCll8／pUCll9&#160;载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链&#160;DNA，又能合成双链&#160;DNA。

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